A havendo questionamento sobre a Gram positividade ou Gram negatividade da cultura, deve ser feita uma coloração controle paralela, com uso de culturas bacterianas conhecidas como Gram positivas, como, por exemplo, aEscheruchia coloI,e Gram negativas, como o Staphylococcus aureus.
B nas bactérias Gram negativas, o tratamento com álcool-acetona não é capaz de remover o corante inicialmente aplicado à cultura devido à espessa camada de peptideoglicanas na parede celular.
C após a primeira coloração, as bactérias Gram positivas formam um complexo azul intenso que não é removido pelo álcool-acetona, pois a parede celular é formada por lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e polissacarídeos que impedem a retirada do complexo cristal violeta-iodo.
D o descoloramento para mais ou para menos da cultura é resultante da incorreta diferenciação pelo álcool-acetona, caracterizando as Gram positivas com coloração rosa ou vermelha e as Gram negativas, roxas.
E as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptideoglicanas sob uma camada de lipoproteínas, fosfolipídeos, proteínas e lipopolissacarídeos, que tem seus lipídeos removidos pelo tratamento álcool-acetona, aumentando a permeabilidade e permitindo a descoloração para posterior revelação.