A Tamanho: a região do oligonucleotídeo complementar ao DNA molde deve ter entre 5 e 10 nucleotídeos, no máximo.
B Composição de bases: o conteúdo G+C deve estar entre 40% e 60%, com uma distribuição equilibrada das quatro bases ao longo do comprimento do oligonucleotídeo.
C Sequências autocomplementares e repetitivas: sequências palindrômicas ou repetitivas com mais de 5 pares de bases podem estar presentes, contanto que estejam na região 5’.
D Temperatura de desnaturação (Melting, Tm): os valores calculados de Tm dos membros de um par de oligonucleotídeos podem diferir em até 8º C.
E Terminal 3’: a natureza dos terminais 3’-OH dos oligonucleotídeos não é tão importante quanto a do terminal 5’-PO4, que deve sempre terminar em G ou C, mas nunca em GC ou CG.